IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) β-galaktozidaza substratynyň analogy bolup, ol ýokary derejede induksiýa ukybyna eýedir. IPTG-niň induksiýasy astynda induktor repressor belogy bilen kompleks emele getirip biler, şonuň üçin repressor belogynyň konformasiýasy üýtgeýär, şonuň üçin ol nyşana gen bilen birleşip bilmeýär we nyşana gen netijeli ekspresirlenýär. Şeýlelikde, synag wagtynda IPTG-niň konsentrasiýasy nähili kesgitlenmeli? Näçe uly bolsa, şonça gowy?
Ilki bilen, IPTG induksiýasynyň prinsipini düşüneliň: E. coli-niň laktoza operony (elementi) degişlilikde β-galaktozidaza, permeaza we asetiltransferaza kodlaýan üç sany gurluş genini, Z,Y we A-ny öz içine alýar. lacZ laktozany glýukoza we galaktoza ýa-da allo-laktoza gidrolizleýär; lacY daşky gurşawdaky laktozanyň öýjük membranasyndan geçmegine we öýjük içine girmegine mümkinçilik berýär; lacA asetil toparyny asetil-KoA-dan β-galaktozide geçirýär, bu bolsa zäherli täsiri aýyrmagy öz içine alýar. Mundan başga-da, O iş tertibi, P başlangyç tertibi we I düzgünleşdiriji gen bar. I gen kody operator tertibiniň O pozisiýasyna baglanyp bilýän repressor belokdyr, şonuň üçin operon (meta) repressiýa edilýär we öçürilýär. Başlangyç P yzygiderliginiň ýokarsynda katabolik gen aktiwatory belok-CAP birikdiriş ýeri üçin birikdiriş ýeri hem bar. P yzygiderligi, O yzygiderligi we CAP birikdiriş ýeri bilelikde lak operonynyň düzgünleşdiriji sebitini emele getirýär. Üç fermentiň kodlaýjy genleri gen önümleriniň utgaşdyrylan ekspresiýasyny gazanmak üçin şol bir düzgünleşdiriji sebit tarapyndan düzgünleşdirilýär.
Laktoza ýok wagty, lak operon (meta) basyş ýagdaýynda bolýar. Bu wagtda, PI promotor yzygiderliliginiň gözegçiligi astynda I yzygiderligi bilen beýan edilýän lak repressory O yzygiderligine baglanýar, bu bolsa RNK polimerazasynyň P yzygiderligine baglanmagynyň öňüni alýar we transkripsiýanyň başlanmagyna päsgel berýär; laktoza bar bolanda, lak operon (meta) induksiýa edilip bilner. Bu operon (meta) ulgamynda hakyky induktor laktozanyň özi däl. Laktoza öýjük içine girýär we β-galaktozidaza tarapyndan katalizlenip, allolaktoza öwrülýär. Soňky induktor molekulasy hökmünde repressor belogyna baglanýar we belogyň konformasiýasyny üýtgedýär, bu bolsa repressor belogynyň O yzygiderliginden we transkripsiýadan aýrylmagyna getirýär. Izopropiltiogalaktozid (IPTG) allolaktoza bilen birmeňzeş täsire eýedir. Ol bakteriýalar tarapyndan metabolizlenmeýän we örän durnukly bolan örän güýçli induktordyr, şonuň üçin ol laboratoriýalarda giňden ulanylýar.
IPTG-niň optimal konsentrasiýasyny nädip kesgitlemeli? Mysal hökmünde E. coli-ni alyp göreliň.
Pozitiw rekombinant pGEX (CGRP/msCT) saklaýan E. coli BL21 genetiki taýdan döredilen ştammy 50μg·mL-1 Amper saklaýan LB suwuk gurşawa sanjym edildi we 37°C-de gijesine ösdürilip ýetişdirildi. Ýokardaky medeniýet giňeltme medeniýeti üçin 1:100 gatnaşykda 50μg·mL-1 Amper saklaýan 10 sany 50ml täze LB suwuk gurşawa sanjym edildi we OD600 bahasy 0.6~0.8 bolanda, IPTG soňky konsentrasiýa goşuldy. Ol 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Şol bir temperaturada we şol bir wagtda induksiýa edilenden soň, ondan 1 ml bakteriýa ergini alyndy we bakteriýa öýjükleri santrifuga arkaly ýygnaldy we dürli IPTG konsentrasiýalarynyň belok ekspresiýasyna täsirini seljermek üçin SDS-PAGE-e sezewar edildi, soňra bolsa iň uly belok ekspresiýasy bolan IPTG konsentrasiýasy saýlanyldy.
Tejribelerden soň, IPTG-niň konsentrasiýasynyň mümkin boldugyça uly däldigi anyklanar. Sebäbi IPTG bakteriýalar üçin belli bir zäherlilige eýedir. Konsentrasiýadan geçmek öýjügi hem öldürer; we umuman aýdylanda, öýjükde has köp ereýän belogyň beýan edilişi, şonça-da gowy bolmagyna umyt edýäris, ýöne köp halatlarda IPTG-niň konsentrasiýasy gaty ýokary bolanda, köp mukdarda goşulma emele geler. Beden, ýöne ereýän belogyň mukdary azalýar. Şonuň üçin iň amatly IPTG konsentrasiýasy köplenç has uly däl-de, has pes konsentrasiýa bolýar.
Genetiki taýdan döredilen ştammlaryň induksiýasy we ösdürilip ýetişdirilmeginiň maksady maksatly belogyň hasyllylygyny ýokarlandyrmak we çykdajylary azaltmakdyr. Maksatly geniň ekspresiýasyna diňe ştammyň öz faktorlary we plazmid ekspresiýasy däl, eýsem induktoryň konsentrasiýasy, induksiýa temperaturasy we induksiýa wagty ýaly beýleki daşarky şertler hem täsir edýär. Şonuň üçin, umuman, näbelli belogyň ekspresiýasy we arassalanmagyndan öň, degişli şertleri saýlamak we iň gowy tejribe netijelerini almak üçin induksiýa wagtyny, temperaturany we IPTG konsentrasiýasyny öwrenmek iň gowusydyr.
Ýerleşdirilen wagty: 2021-nji ýylyň 31-nji dekabry